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'Madeleine Gans, la génétique de la drosophile'par Denise Busson-Cabet, Claudie Isnard-Lamour et Odile Ozier-Kalogeropoulos (janvier 2014) |
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Biographie
Madeleine Gans, née le 5 juin 1920 à Pont-à-Mousson en Lorraine, fait ses études de médecine durant la seconde guerre mondiale, d’abord à Nancy puis à Rennes et enfin à Toulouse où elle obtient le titre de docteur en médecine ainsi que des certificats universitaires de chimie et de biologie. Elle entre en 1945 dans le laboratoire que Boris Ephrussi vient de créer à l’Institut de Biologie Physico-Chimique (IBPC) à Paris. Elle soutient sa thèse en 1951 sur l’étude du mutant zeste chez Drosophila melanogaster. En 1956, elle entreprend avec Georges Prévost, autre élève de B. Ephrussi, des travaux sur un nouveau modèle, le champignon Coprinus radiatus, d’abord à Paris, puis à Gif-sur-Yvette dans le laboratoire de Génétique Physiologique. En 1967, elle intègre avec son équipe le nouveau Centre de Génétique Moléculaire (CGM) du CNRS. Georges Prévost, nommé professeur à l'Université de Paris-Sud s'installera peu après dans le laboratoire de Biologie Générale à Orsay. En 1970, M. Gans revient au modèle Drosophile sur lequel elle est l’une des premières à aborder l’étude du développement par des méthodes génétiques. Elle poursuit ses recherches jusqu’en 1990.
Elle entre au CNRS, comme stagiaire en 1945 puis chargée de recherches en 1952. Elle est nommée chef de travaux pratiques de génétique à la Sorbonne en 1953 puis professeur de génétique à la Faculté des Sciences de Paris en 1961. Elle participe, en 1956, à la création du certificat de troisième cycle de Génétique approfondie. En 1965, ce certificat est transformé en diplôme d’études approfondies (DEA) de Génétique. Pendant plusieurs années, Madeleine Gans et Piotr Slonimski en assureront la direction et y impulseront un mode d'enseignement unique en France. Ce DEA qui a formé des centaines de jeunes chercheurs, a connu une notoriété nationale et internationale.
Madeleine Gans est élue correspondante à l’Académie des Sciences en 1987.
Travaux scientifiques
L’utilisation de la méthodologie génétique pour la dissection des processus biologiques est le fil conducteur de l’ensemble des travaux de Madeleine Gans. Elle est mondialement connue pour avoir initié, en France, l’étude génétique du développement chez la Drosophile. Cependant, elle a appliqué avec succès l’outil génétique à l’analyse d’autres processus, tels que les recombinaisons somatiques, la dissection des voies métaboliques, l’étude de la structure fine de gènes chez le Coprin et l’étude des phénomènes de mobilisation à haute fréquence d’éléments génétiques instables chez la Drosophile.
Les relations complexes entre génotype et phénotype
Dans la ligne des travaux de B. Ephrussi et G.W. Beadle sur les mutants de pigmentation de l’œil chez la Drosophile [1], Madeleine Gans publie en 1953 son travail de thèse intitulé « Etude génétique et physiologique du mutant z de Drosophila melanogaster » [2]. Cette thèse sera traduite en anglais à l’usage des étudiants en génétique des universités américaines. Dans cette superbe étude de génétique classique, M. Gans décrit la complexité des relations entre génotype et phénotype. Elle met en évidence dans ce système des phénomènes d’interaction entre gènes tels que transvection, effet de position et variégation.
La souche mutante zeste1 (z1) a des caractéristiques intrigantes. En effet, de façon stable au cours des générations, les femelles ont l’œil jaune citron alors que les mâles ont l’œil brun-rouge comme les mouches de référence. Madeleine Gans montre que cette propriété ne dépend pas du sexe des mouches mais du nombre de doses du gène white+, très proche du gène zeste. Grâce aux remaniements chromosomiques qui affectent la région zeste-white, M. Gans montre que le phénotype mutant ne s’exprime que si le gène white+ est en double exemplaire. Les gènes considérés étant sur le chromosome X, le phénotype mutant résultant de l’interaction z1-w+ s’exprime chez les femelles XX et pas chez les mâles XY. En outre, Il sera montré ultérieurement que les deux exemplaires du gène white+ doivent être appariés [3]. Ce phénotype particulier fera entrer l’interaction zeste-white dans le cadre plus large des phénomènes de transvection, décrits à la même époque par Edward B. Lewis pour des mutants du locus Bithorax [4]. On parle de transvection lorsque la régulation de l’expression d’un gène donné dépend de l’interaction physique entre les deux copies (allèles) de ce gène et nécessite l’appariement des chromosomes homologues portant ces allèles. Ce phénomène se réfère le plus souvent à des interactions physiques entre région cis-régulatrice de l’une des copies et région promoteur de l’autre copie. Dans le système étudié, la protéine Zeste serait un « facilitateur » de tranvection [5] [6].
Dans sa thèse, M. Gans analyse très précisément le phénomène d’effet de position. En effet L’expression d’un gène dépend de sa séquence et de ses régions de contrôle mais aussi de son environnement génétique. On sait qu’il existe des régions génétiques dites « ouvertes », au sein desquelles un gène peut s’exprimer (euchromatine) et des régions génétiques dites « fermées » qui ne permettent pas cette expression (hétérochromatine). Madeleine Gans met en évidence ce phénomène grâce aux remaniements chromosomiques qui affectent la région du gène w+ ; en position normale, à l’extrémité du chromosome X, w+ s’exprime et l’interaction z1w+a lieu ; en position anormale, proche de l’hétérochromatine centromérique, w+ ne s’exprime pas et l’interaction z1w+ n’est pas détectée.
Enfin, un autre phénomène analysé dans cette thèse est celui de variégation, via l’observation du phénotype de panachures. Pour une constitution génétique donnée, par exemple des femelles z1w+/z1w+, selon les conditions de température, M. Gans observe, à 26°C des yeux de phénotype mutant jaune citron, à 15°C des yeux du phénotype brun-rouge de référence et à 20°C des yeux « panachés » où certaines ommatidies (unités optiques de l’œil) sont de phénotype mutant et d’autres de phénotype non mutant. Ce phénotype de panachures est un exemple d’effet de seuil dans l’expression génique. On observe aussi ce phénomène par effet de position [7], on parle alors de variégation par effet de position.
La thèse de M. Gans va initier un nombre impressionnant de travaux sur le gène zeste qui donneront lieu à des dizaines de publications dans les meilleures revues, travaux qui se poursuivront encore jusque dans les années 2000-2010, près de 60 ans après l’étude initiale.
On sait maintenant que la protéine Zeste se lie à l’ADN et présente des propriétés d’auto-agrégation. Elle intervient dans la régulation de l’expression du gène white et de nombreux autres gènes, d’une part via son rôle sur l’état ouvert ou fermé de la chromatine et d’autre part via son influence sur l’appariement des chromosomes homologues intervenant dans la régulation des gènes. La protéine mutante Zeste1 a des propriétés d’hyper-agrégation qui rendent compte de son effet répressif sur l’expression du gène white+ [6].
La génétique physiologique du Coprin
Après sa thèse, Madeleine Gans s'associe à Georges Prévost pour travailler sur le champignon basidiomycète Coprinus radiatus. Les basidiomycètes possèdent une spécificité biologique particulièrement intéressante : la fusion de deux mycéliums haploïdes ne concerne dans un premier temps que les cytoplasmes (plasmogamie), la fusion des noyaux (caryogamie) n'aura lieu que plus tard dans les basides des carpophores. Dans chaque cellule de ce nouveau mycélium, deux noyaux haploïdes sont donc présents et se divisent de façon conjuguée, maintenant l'égalité numérique des deux types de noyaux. Cet état dicaryotique, très stable, est un matériel idéal pour étudier les relations entre noyau et cytoplasme. Par ailleurs, à la fin des années 50, à la suite des travaux de G.W. Beadle et E.L. Tatum, (prix Nobel de physiologie ou médecine avec J. Lederberg en 1958), les études génétiques s’étaient largement tournées vers l’analyse fonctionnelle des gènes [8]. Or, il était possible de réaliser facilement chez le Coprin, grâce à la phase dicaryotique, les tests de complémentation fonctionnelle nécessaires à cette nouvelle approche génétique.
En quelques années, une collection d'une centaine de mutants est constituée et la cartographie génétique d'une soixantaine de ces marqueurs est effectuée. G. Prévost et M. Gans réalisent ainsi la première cartographie génétique à grande échelle d'un basidiomycète [9].
Les thèmes se diversifient faisant tous appel à la méthodologie génétique : recombinaisons somatiques [10] [11], structure génétique des locus d'incompatibilité sexuelle [12], étude caryologique confirmant la cartographie génétique établie antérieurement [13] et analyse des voies de biosynthèse grâce aux nombreux mutants biochimiques isolés par G. Prévost [9]. Les travaux porteront principalement sur l’étude des voies de biosynthèse des pyrimidines (mutants auxotrophes pour l'uracile) et de l'arginine (mutants auxotrophes pour l'arginine).
La structure fine du locus complexe ur-1 est déterminée. Ce locus est composé de deux gènes appartenant à une seule unité de transcription [14]. Ces deux gènes gouvernent, comme chez la levure Saccharomyces cerevisiae [15], les deux premières étapes de la voie de biosynthèse des pyrimidines.
Madeleine Gans et son équipe montre que chez le Coprin [16] comme chez Neurospora crassa [17], il existe deux voies de biosynthèse distinctes pour le carbamyl-phosphate, précurseur commun des pyrimidines et de l’arginine. Les résultats obtenus conduisent à proposer un modèle où le carbamyl-phosphate serait fabriqué par deux complexes enzymatiques ayant des localisations cellulaires différente : mitochondriale pour les enzymes de la chaine de l'arginine et cytoplasmique pour celles de la chaine des pyrimidines [18] [19]. Cependant, dans certaines conditions, une
« décanalisation » du carbamyl-phosphate de la biosynthèse de l'arginine peut avoir lieu [20].
Les travaux réalisés sur le Coprin au laboratoire entre le milieu des années 50 et le début des années 70, ont fait avancer de façon notable les connaissances concernant la biologie d'une espèce représentative des basidiomycètes, embranchement peu étudié à l'époque. De plus, des circuits de régulations métaboliques identifiés chez ce basidiomycète ont pu être comparés aux circuits équivalents d'espèces proches appartenant à l'embranchement des ascomycètes ou d'espèces plus éloignées, procaryotes et eucaryotes.
L’étude génétique du développement
Les mutants à effet maternel
A la fin des années 60, l’idée que la génétique pouvait être une approche fructueuse pour l’étude des mécanismes du développement a commencé à s’imposer. Le grand précurseur dans ce domaine a été sans conteste Edward B. Lewis (prix Nobel de physiologie ou médecine avec C. Nusslein-Volhard et E. Wieschaus en 1995) pour ses travaux sur les mutants homéotiques de la Drosophile [21] [22]. Madeleine Gans a été en France l’initiatrice de cette nouvelle approche de l’embryologie qui deviendra la génétique du développement. Pour aborder cette nouvelle voie, elle est revenue à son organisme fétiche, la Drosophile.
L’idée qui sous-tendait ses recherches est basée sur le fait que l’ovocyte de Drosophile est une grosse cellule polarisée selon deux axes, antéro-postérieur et dorso-ventral, qui préfigurent les axes de l’embryon, de la larve et de l’imago (adulte). Cette polarisation, présente avant la fécondation, ne pouvait résulter que de la présence dans le cytoplasme de l’ovocyte d’éléments produits pendant l’ovogenèse sous le contrôle des gènes de la mère. Madeleine Gans a fait l’hypothèse que des mutations dans ces gènes, appelés « gènes à effet maternel », pourraient avoir un effet retardé touchant certaines structures, embryonnaires, larvaires ou adultes, des descendants des femelles mutantes.
Plusieurs mutagenèses ont été réalisées dans le laboratoire dans le but de rechercher de tels mutants [23]. A partir de plus de 1000 lignées examinées, 95 mutants de ce type ont été isolés permettant d’identifier 60 gènes. Un ensemble de 93 mutants, correspondant à 58 gènes, se caractérisait par une stérilité des femelles. Pour une partie d’entre eux, la stérilité était dûe à une absence de ponte ou à la ponte d’œufs ne se développant pas (30 gènes). Pour les autres, la stérilité était dûe à la production d’œufs morphologiquement normaux dont le développement était initié mais s’interrompait à un stade plus ou moins tardif au cours de l’embryogenèse. Cette catégorie de mutants (28 gènes) était celle recherchée. Si dans la plupart des cas, l’arrêt du développement se situait avant la gastrulation. pour quelques mutants, il intervenait plus tardivement au cours de l’organogenèse. Cependant aucun défaut touchant une structure spécifique n’a pu être mis en évidence chez ces embryons létaux [24] [25].
Deux lignées mutantes dites grandchildless, se sont montrées particulièrement interessantes : les femelles mutantes étaient fertiles et donnaient naissance à des descendants mâles et femelles viables mais stériles, car dépourvus de cellules germinales [23] [26] [27]. Les gènes touchés chez ces mutants étaient donc nécessaires à la production au cours de l’ovogenèse d’un déterminant requis pour la formation des cellules germinales du futur embryon. Cependant, l’absence de cellules germinales était souvent accompagnée d’autres défauts, touchant en particulier des structures postérieures des adultes.
Le résultat majeur des travaux de l’équipe de M. Gans a été de montrer que les produits des gènes à effet maternel déposés dans l’ovocyte étaient effectivement impliqués dans la mise en place des structures des embryons, mais aussi de celles des larves et des adultes issus de ces ovocytes. Une observation importante était que l’action d’aucun de ces gènes ne semblait spécifique d’une structure particulière, pas même ceux impliqués dans la formation des cellules germinales. C’est beaucoup plus tard, à la fin des années 80, que cette absence de spécificité a pu être expliquée. En effet, il a été montré que les produits des gènes à effet maternel n’étaient pas localisés mais répartis dans l’ovocyte sous forme de gradients de densité. L’absence d’un de ces produits entrainait donc des défauts étendus à de grandes regions de l’embryon [28] [29].
Les travaux de M. Gans ont été précurseurs. Dans le milieu des années 70, très peu d'équipes dans le monde ont utilisé l’approche génétique pour étudier l’ovogenèse. Ce fut le cas d’Alan Garen [30] et J. Dawson Mohler [31] qui ont recherché des mutants de stérilité femelle selon une démarche similaire à celle de M. Gans sans aller toutefois, jusqu’à la recherche de mutants de type grandchildless.
En 1980, la puissance de l’approche par mutagenèse de l’étude du développement sera confirmée de façon magistrale par les travaux [32] de Christiane Nüsslein-Volhard et Eric Wieshaus, co-laurétats avec E.B. Lewis du prix Nobel de physiologie ou médecine 1995.
Les mutants ovoD et l’analyse clonale en lignée germinale femelle
Dans une des mutagènes réalisées pour identifier des gènes à effet maternel sur le chromosome X des mutants appelés ovoD ont été obtenus [33]. Leurs propriétés étonnantes sont d’emblée reconnues par M. Gans dans l’article qu’elle publie en 1983 [34].
Les mutations ovoD sont à effet dominant conduisant à une stérilité femelle totale tandis que les mâles qui les portent sont parfaitement fertiles. Ces mutations sont actives en lignée germinale femelle. Des études ultérieures montreront que les produits du gène ovo sont impliqués dans la viabilité et l’identité sexuelle de la lignée germinale femelle. Madeleine Gans reconnaît d'emblée l’avantage exceptionnel qu’offrent ces mutations pour étudier le rôle éventuel, au cours de l’ovogenèse, d’autres mutations « x » , qui entraînent, à l’état homozygote, la létalité des mouches mutantes x/x [34].
Si l’on construit des femelles de génotype double hétérozygote ovoD x+/ovo+ x, celles-ci sont totalement stériles par suite de la présence de ovoD. Cependant par recombinaison mitotique induite par irradiation aux rayons X, on peut obtenir deux types cellulaires jumeaux, des clones cellulaires ovoD x+/ ovoD x+ et des clones ovo+ x /ovo+ x. Dans l’ovaire, seul le deuxième type de clones donne des cellules germinales potentiellement capables de donner des descendants. L’analyse du phénotype des descendants permettra d’identifier le rôle germinal éventuel des mutations x.
Toutes les potentialités de cet outil ont été développées par Norbert Perrimon, d’abord comme étudiant en stage de DEA dans le laboratoire de M. Gans [35], puis au cours de sa thèse, dans le laboratoire d'Anthony Mahowald aux USA [36]. Il apportera deux perfectionnements majeurs à cette technique. D’une part, la combinaison du système ovoD avec le système Flp-FRT qui permet l’induction à haute fréquence de clones germinaux [37], d’autre part, le transfert par transgenèse de la mutation ovoD sur les bras des deux grands chromosomes autosomiques de la Drosophile, ce qui permet d’étendre ce type d’analyse clonale aux mutations x autosomiques [38] [39]. Des dizaines d’équipes de chercheurs impliqués dans l’étude génétique du développement de la Drosophile utiliseront ces outils.
De la réversion à haute fréquence des mutations ovoD au contrôle de la mobilisation des transposons par les piRNAs
Au cours de l’analyse génétique très précise des descendants des clones germinaux décrits ci-dessus, M. Gans découvre un phénomène inattendu : certains descendants viables sont dûs non à une recombinaison mitotique mais à une réversion phénotypique des mutations ovoD en lignée germinale femelle. Cette réversion se produit à haute fréquence, jusqu’à 6% des femelles pouvant contenir de tels clones révertants [34]. Les évènements de « réversion » transforment les mutations ovoD en mutations ovo0 qui se comportent comme une perte de fonction du gène ovo et conduisent à une stérilité femelle récessive. Ces « réversions » s’accompagnent fréquemment de mutations de gènes adjacents au gène ovo (4% des cas de réversions) ou de mutations situées ailleurs dans le génome (5% des cas). De plus, leur fréquence dépend grandement du génotype des mères donnant les femelles ovoD/+ chez lesquelles se produiront de tels clones.
A partir de ces propriétés, l’hypothèse de la mobilisation, dans certaines conditions, d’un élément transposable est explicitement formulée, avec deux possibilités : soit les mutations ovoD sont dues à l’insertion d’un transposon et leur « réversion » résulte de l’excision de ce transposon, soit les mutations ovoD sont des mutations ponctuelles et c’est la mobilisation et l’insertion d’un transposon qui conduisent à l’inactivation du gène ovo et dans certains cas à celle d’autres gènes.
La suite immédiate de l’étude est la recherche du transposon responsable. Dès 1989, l’équipe de M. Gans montre que la mobilisation des rétrotransposons gypsy et copia induit la « réversion » des mutations ovoD [40]. L'analyse est poursuivie en collaboration avec l’équipe d’Alain Bucheton et Alain Pélisson. Les conditions de la mobilisation de gypsy sont précisées. Comme suggéré dans l’étude princeps [34], cette mobilisation dépend du génotype des mères des femelles ovoD/+. L’élément génétique responsable, appelé flamenco (flam), est localisé dans l’hétérochromatine proximale du chromosome X [41]. Dans la plupart des souches, gypsy est stable et ne transpose pas, le « gène » flamenco est présent sous une forme allélique active (flamR, allèle restrictif) qui permet le contrôle de gypsy. Dans certaines souches, flamenco est présent sous une forme allélique mutante (flamP, allèle permissif) qui ne permet plus le contrôle de gypsy : gypsy est instable et transpose à haute fréquence dans la lignée germinale des filles de femelles homozygotes pour une mutation de flamenco.
Plusieurs équipes, dont celle d'Alain Bucheton et Alain Pélisson et celle de Victor Corces préciseront les conditions de la mobilisation de gypsy. Chez les femelles ovo+ flamP/ovo+ flamP, il y a amplification des rétro-éléments gypsy dans les cellules folliculaires des ovaires, puis passage dans les ovocytes. Chez les femelles ovoD/ovo+ résultant de la fécondation de ces ovocytes par un spermatozoïde ovoD, les particules gypsy présentes dans l’embryon infecteront les cellules à l’origine de la lignée germinale. L’intégration d’une particule gypsy dans ovoD permettra la formation de cellules germinales ovo0/ovo+ viables et fécondables. Dans ce système, la constitution génétique ovoD/ovo+ sert de test permettant de suivre la mobilisation et la transposition de gyspsy.
Mais qu’en est-il du « gène » flamenco et quelle est sa fonction ? L’équipe d’Alain Bucheton et Alain Pélisson d’une part [42], de Bernard Dastugue et Chantal Vaury [43] d’autre part, montrent que le locus flam, appelé parfois COM (centre organisateur de mobilisation), contrôle aussi la mobilisation d’autres rétrotransposons tels que ZAM et Idefix. Sa localisation est précisée, dans l’hétérochromatine b péricentromérique, couvrant une région d’au moins 130 kb. Mais jusqu’en 2007, en utilisant les méthodes classiques de biologie moléculaire, le clonage de flam n’aboutit pas.
Parallèlement à ces travaux, depuis les années 1990 et la découverte de l’ARN-interférence par ARN double-brin [44] [45], le monde des petits ARNs et de leurs effets biologiques est en perpétuelle expansion : siRNAs « small-interfering RNAs », miRNAs « micro-RNAs », piRNAs « piwi-associated RNAs », rasiRNAs « retro-transposon associated small-interfering RNAs », etc.
En 2007, l’équipe de G.J. Hannon publie une analyse systématique de la localisation génomique des piRNAs dans les ovaires de Drosophile [46]. Il identifie ainsi les locus correspondant à des sites de production de piRNAs. Le site majeur correspond au locus flamenco/COM ! 87% de sa séquence correspond à des répétitions de fragments de rétrotransposons : gypsy, Idefix, ZAM et d’autres transposons sur 179 kb ! La suite de l’analyse montrera que ces piRNAs sont pris en charge par la protéine Piwi et correspondent au brin antisens complémentaire des transcrits sens des transposons ciblés. D’où le modèle proposant que le locus flamenco produit de longs transcrits précurseurs antisens qui seront clivés en petits ARNs chargés par la protéine Piwi. Ces complexes à leur tour iront s’hybrider aux transcrits sens des transposons actifs présents dans le génome provoquant leur destruction (« silencing ») [47].
En conclusion, l’histoire des mutants ovoD illustre de façon évidente comment la maîtrise de la méthodologie génétique et le flair scientifique de Madeleine Gans ont permis d’ouvrir les pistes prometteuses que ces mutants offraient tant pour l’analyse clonale en lignée germinale que comme révélateur du contrôle de la mobilisation des transposons. Ainsi ont été posées et disséquées les bases de recherches qui continuent à se développer aujourd'hui, plusieurs dizaines d'années après les études initiales.
Articles scientifiques majeurs de Madeleine Gans
- Gans M. (1953). Etude génétique et physiologique du mutant z de Drosophila melanogaster. Suppléments au Bulletin Biologique de France et de Belgique PUF Supplément XXXVIII : 1-90.
- Gans M., Masson, M. (1969). Structure fine du locus ur-1 chez Coprinus radiatus, Molec. Gen. Genetics 105: 164-181.
- Gans M., Audit C., Masson M. (1975). Isolation and characterization of sex-linked female-sterile mutants in Drosophila melanogaster. Genetics 81: 683-704.
- Busson D., Gans M., Komitopoulou K., Masson M. (1983). Genetic Analysis of Three Dominant Female-Sterile Mutations Located on the X Chromosome of Drosophila melanogaster. Genetics 105(2):309-25.
Notes et références
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[2] Gans M. (1953). Etude génétique et physiologique du mutant z de Drosophila melanogaster. Suppléments au Bulletin Biologique de France et de Belgique PUF Supplément XXXVIII: 1-90.
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